人工合成乙酰化唾液酸苷分子用于识别人类呼

大家好，今天小蜗牛跟大家分享的是近期发表在NatureChemistry上的一篇糖化学生物学文献，该工作通过化学酶法合成了一系列的O-乙酰化唾液酸苷，并将其用于人类呼吸道病毒功能受体的鉴定。

本文的通讯作者是Geert-JanBoons教授。他的主要研究方向为：糖类化合物和糖复合物的合成及生物学功能研究新型糖基化方法。

背景介绍

自年COVID-19大流行以来，冠状病毒又一次强势进入人们的视野，截至北京时间4月7日，全球新冠肺炎累计确诊病例突破1.3亿例；累计死亡病例超过万例。除此以外，众多人畜共患的冠状病毒已在人群中流行，例如：甲型冠状病毒NL63和E病毒及乙型冠状病毒OC43和HKU1病毒。为防止冠状病毒再次爆发，我们需要从根本上了解这些冠状病毒如何在人体内复制，其中一个重要的环节就是了解病毒与受体的结合模式。

据哺乳动物细胞表面与病毒结合相关的糖链种类，唾液酸苷是一类重要的病毒结合受体。但是对于使用唾液寡糖作为受体的易感脊椎动物病毒来说，很难确定受体结合的特异性。但是这一信息对于确定脊椎动物物种间唾液聚糖储备的差异，以及阻断人畜共患病毒在人类中造成感染至关重要。同时，有文献报道了O-乙酰化的唾液酸苷是冠状病毒结合的重要受体。

基于此，本文作者探究了一组O-乙酰化修饰的唾液酸受体与病毒结合特异性，表明病毒识别并结合宿主特异性与唾液酸O-乙酰化模式和糖苷键连接类型有关。

哺乳动物体内唾液酸苷的多样性

图a.唾液酸苷骨架结构图b.O-乙酰化修饰的唾液酸苷

化学酶法合成唾液酸苷

尽管O-乙酰化唾液酸存在于哺乳动物许多不同的组织中，但对他们生物合成过程以及生物功能的研究非常有限。因此，本文作者首先建立了一种通用的化学合成方法，用于合成α2,3-,α2,6-andα2,8连接的唾液酸苷1a,2a和3a。

三个前体化合物1a,2a和3a

三个化合物的合成用到了类似的合成路线，以化合物1a的合成为例。

得到1a,2a和3a之后，作者从病毒血凝素酯酶（HEs）具有唾液酸酯-O-乙酰酯酶活性中得到启示，牛冠状病毒(BCoV)HE是一种9-O-乙酰酯酶，而小鼠肝炎病毒株S(MHV-S)产生的HEs对唾液酸酯-4-O-乙酰酯有特异性。作者利用这两种酶对不同位点乙酰酯特异性脱除，结合已经报道的控制C-7乙酸酯向C-9迁移的方法（NH4HCO3），几乎可以合成文中介绍的所有唾液酸乙酰化产物。

化学酶法进行唾液酸苷O-乙酰化修饰的三种策略

最终作者得到了15个化合物。根据唾液酸跟糖基受体的连接方式，这15个化合物被分为三类，分别是α2,3-,α2,6-和α2,8连接的唾液酸苷，如图所示。

化学酶法合成的O-乙酰化唾液酸苷化合物

病毒受体结合模式筛选

得到唾液酸糖苷的化合物库后，作者利用糖芯片技术，筛选并得出常见的引起人类上和其他动物上呼吸道疾病的冠状病毒及流感病毒，与唾液酸糖苷的结合能力规律。

作者先利用糖芯片技术筛选病毒与唾液酸的结合特异性，分别测试了冠状病毒的刺突蛋白（S）、病毒血凝素酯酶(HE)与受体的结合情况，用免疫荧光法检测的相对荧光单位值（RFU）表征特定蛋白与受体的结合强度。

糖芯片技术筛选病毒与唾液酸的结合特异性

实验结果表明，来源于人的冠状病毒OC43和HKU1的刺突蛋白(S)以及人流感病毒ICV的病毒血凝素酯酶融合蛋白(HEF)对9-O-乙酰酯修饰过的α2,8-连接的双唾液酸表现出明显的结合特异性。

在此基础上，作者想要证明，这两种冠状病毒由刺突蛋白介导的与糖苷的结合是否能促进感染。于是，他们选了唾液酸转移酶ST8Sia1，这种酶能产生神经节苷脂GD3，这种神经节苷脂是一种α2,8-连接的双唾液酸糖酯，并且它在人体内可以被乙酰化修饰为糖复合物（9-Ac-GD3）。并选用了能自然表达CASD1的HEKT细胞，CASD1是一种N-乙酰神经氨酸9-O-乙酰转移酶，通过用ST8Sia1转染这些细胞，产生9-Ac-GD3。

细胞荧光实验及感染率柱状图

细胞免疫荧光实验结果说明9-Ac-GD3是两种冠状病毒的结合受体，并且表明病毒与受体的结合需要一个完整的受体结合域（S1A）。

免疫组化实验

最后，作者用人上呼吸道的鼻腔和下呼吸道的肺泡组织进行免疫组化实验。实验结果表明，两种野生型S1A蛋白均可以进入人体上呼吸道，S1A缺失的病毒均未观察到结合。这个实验说明，9-O-乙酰化双唾液酸糖苷在人上呼吸道和下呼吸道中都表达，也解释了为什么呼吸道是发生冠状病毒感染的主要部位。

小蜗牛点评：

该工作是一项非常有意义且具有挑战性的工作，作者巧妙地利用化学合成和化学酶法合成的策略完成了15个复杂唾液酸苷的合成，并利用糖芯片技术筛选出针对不同冠状病毒和部分流感病毒与多种唾液酸受体结合的特异性。最后作者利用细胞荧光实验和免疫组化实验确定了冠状病毒与宿主受体识别并结合所必备的条件。该工作从分子水平解释了宿主细胞表面的的具体唾液酸结构影响与冠状病毒结合的特异性！

该工作仍然有部分可以给读者思考的空间，作者在基因芯片实验中仅仅使用了病毒的刺突蛋白来模拟病毒与受体的结合，与真实病毒的结合可能略有差异。除此之外，文中如果能增加部分近年来广受