解读mNGS共识丨鲁炳怀教授mNGS

临床微生物样本采集与结果解读是从事临床感染与微生物的医务人员每天都要面临的问题。实际上，刚进入微生物室工作的大夫也常会询问这样一个问题：「培养基上长这么多菌落，我给临床报告哪一个，哪个才是真正的致病菌？」现在应用mNGS，情况与以往不同，不论做出什么结果，屏蔽的不多，大部分检测到的序列都会上报给临床。同样，现在也出现了临床医生以前没有遇到的问题，比如检测一个呼吸道样本，以前微生物室的医生基本不会报告「肠球菌」给临床，不论是屎肠球菌还是粪肠球菌，但是现在很多mNGS的报告中会出现。有些临床医生拿到这样的报告，就会询问：「是不是因为肠球菌培养困难，所以没有培养出来？而真正的病原是肠球菌。」实际上，很多微生物室医生都知道，在传统的概念里，肠球菌很少引起呼吸道感染，所以微生物实验室在血平皿上见到肠球菌，基本也不会上报临床的。这多数情况下是口腔内菌群污染样本所致。

同时，在mNGS的应用过程中，开拓了我们的眼界。比如一些少见的病原体，以前诊断鹦鹉热衣原体是非常罕见的，因为常规方法检测不到，而且临床也很少考虑到这种病原体，考虑到以后也没有更好的检测手段。但现在mNGS应用比较广泛，常会碰到鹦鹉热衣原体的报告，反而肺炎衣原体很少见了。另外，还有一些患者的呼吸道样本中有解脲脲原体，以前我也不会想到肺泡灌洗液怎么会去测解脲脲原体呢？但是mNGS结果告诉我们，呼吸道中有这种病原体，而且应用PCR技术进行验证，的确有解脲脲原体的存在。

总之，mNGS不仅给我们提供了许多答案，还给我们提出了很多问题，也让我们的视野更加开阔。

下面对部分《mNGS共识》进行解读

共识29

首先要明确「结果解读与样本的质量有关」，正确解读是建立在合格的样本的基础上。这项技术不论有多么先进，做培养组学、基因组学或者转录组学，它只是告诉你进入实验流程的，临床采集的这份样本中有哪些微生物，而不是就能明确告诉你这是哪一种病原的感染。所以，留取一份合格的样本永远是正确解读结果的前提。

解读报告考虑如下参数：测序质量（是否去除低复杂度、低质量序列，Q20、Q30等）、读长、特异性读长、覆盖率、深度、丰度、微生物序列的数据量、阈值等。要确定报告合格、可信。

共识30

mNGS检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口）。确认致病微生物时，应考虑检出微生物是否为感染部位的潜在病原。比如发现了一个很罕见的、文献里从来没有报道过这个部位可以有这种病原微生物感染和常见的环境微生物的感染，如果出现这样的情况，一定要提高警惕，注意排除常见定植菌、污染菌与工程菌的影响。

另外，比如脑脊液检出新型隐球菌，呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病毒（有些无症状儿童可能检出腺病毒）、流感病毒，关节液或血液标本检出布鲁菌属，常规情况下我们认为是致病微生物，但也不是绝对的，比如我们做Xpert的时候，检测出结核分枝杆菌不一定会就诊断为结核病，它可能是死亡的病原体，也可能是在留取肺泡灌洗液的过程中，上一个患者是阳性，经过消毒处理后，再给下一个患者采集样本。其实下一个患者并没有感染，只是死亡菌体的DNA还是存在的，被检测到了。所以，做mNGS也是这样，如果出现与临床不是特别相符的情况，要多加考虑。

病毒性肺炎

个人认为，检测常见的病毒不是mNGS的强项，就像现在筛查新型冠状病毒，肯定不会去做mNGS，而采用PCR技术。常见的病毒以后可能会通过Realtime-PCR、POCT多重PCR检测来解决这个问题。呼吸道病毒感染的种类相对来说比较有限，常见的最多有十余种，所以特别适合多重PCR快速检测。

这篇文献研究了对于18岁以上成人和18岁以下儿童，在无症状对照和CAP患者中使用rRT-PCR进行呼吸道病毒检测。发现在所有年龄段的CAP患者中检测到流感病毒、呼吸道合胞病毒和人类偏肺病毒，可能表明其致病作用，而副流感病毒、冠状病毒、鼻病毒和腺病毒可在无症状人群检测阳性，尤其是儿童。

依据这一类的研究大致可以推断，有些病原体的检出很少会成为定植菌或者污染菌，绝大多数情况下检出即有价值，比如腺病毒、隐球菌、结核分枝杆菌等。

cell-freeDNA在血流感染中的应用

共识31

血浆样本对cfDNA进行mNGS检测时，建议从临床的角度鉴别检出序列属于致病微生物、样本污染、死亡微生物裂解，还是定植菌群所致的一过性菌血症。

也就是说，采用mNGS检测出的一些口腔链球菌、血链球菌、肠球菌的reads时，并不意味着样本中一定存在这种病原体的感染，可能就是在口咽部定植量比较大释放入血，不可以此根据患者血液样本中的肠球菌、链球菌等感染判断。当然，此类菌引起的血流感染，mNGS也会检测阳性。

这篇文献应用多重PCR技术直接检测血浆中的曲霉菌、镰刀菌等特征性的序列，此类方法可能在国内尝试不多。如果血液样本检出曲霉菌或其他真菌的游离DNA，并不意味着此类微生物入血，可能是游离的DNA入血所致，与其他部位的侵袭性真菌感染有较大相关性。

PNAS发布的这篇文章告诉我们，mNGS分子检测方法和传统培养方法各有所长，从肺炎克雷伯菌的比例就可以看出来，并不是mNGS一定比培养更灵敏。

共识32

注意感染诊断的多种方式，即