文献分享一篇利用原子力显微镜和单分子

在细菌侵染宿主细胞的过程中，细菌尾部的鞭毛在细菌粘附和菌体固定中发挥着不可替代的作用。因此，研究细菌鞭毛如何附着在宿主细胞对理解细菌感染过程是十分关键的。德国慕尼黑科技大学的HaukeClausen-Schaumann教授年在ACSNano发表的“SingleMoleculeForceSpectroscopyRevealsTwo-DomainBindingModeofPilus?1TipProteinRrgAofStreptococcuspneumoniaetoFibronectin”是一篇利用原子力显微镜和单分子力谱技术对肺炎双球菌中的鞭毛蛋白RrgA与宿主细胞表面纤维蛋白的作用的研究，并提出了Two-Domain绑定模型，揭示了鞭毛蛋白RrgA在细菌侵染宿主细胞的过程中的作用，对研究细菌侵染机理有着重要的意义。

一、RrgA蛋白的简单介绍

图1肺炎双球菌鞭毛结构示意图

肺炎双球菌的鞭毛由3种蛋白构成：RrgC、RrgB、RrgA。其中RrgC蛋白起到了连接鞭毛和菌体的作用，RrgB蛋白是鞭毛的骨架蛋白，而RrgA蛋白处于鞭毛的尾端部分。RrgA蛋白由四个Domain竖直排列组成，从上至下依次为D3、D2、D1、D4。其中D2和D4domain中分别存在异肽键，起到了稳定蛋白结构的作用。

图2RrgA蛋白结构示意图

二、实验部分

用常用的PEGLinker将纤维蛋白固定在玻璃板上，并用同样的方法将RrgA蛋白固定在针尖上，以nm/S的拉伸速度进行单分子力谱的拉伸试验，得到单分子力谱曲线并根据PEG和蛋白的长度和worm-likechain(eWLC)model进行筛选得到平均断裂力为51.6±2.0pN、平均长度为nm的力谱曲线。值得注意的是力谱曲线除了单峰外，还有双峰的存在，说明RrgA蛋白与纤维蛋白可能存在多domain的作用。之后改变拉伸速度得到不同拉伸速率下的蛋白粘附力，根据Bell?Evansmodel和计算公式计算出蛋白在零力下的△X=0.25±0.02nm，koff=3.91±0.88S-1,τ=1/koff=0.26±0.06S-1，τ值代表了蛋白相互作用的时间。说明了RrgA蛋白与纤维蛋白之间的作用是弱且短暂的。随后利用分子生物学技术分别对四个domian单独与纤维蛋白进行了拉伸试验得出只有D3和D4domain与纤维蛋白存在相互作用，并用相同的方式得到D3domain与纤维蛋白的粘附力为52.8±1.8pN，△X=0.19±0.02nm，koff=6.72±1.21S-1,τ=1/koff=0.15±0.03S-1。D4domain与纤维蛋白的粘附力为46.2±1.5pN，△X=0.32±0.03nm，koff=2.33±0.53S-1,τ=1/koff=0.43±0.1S-1。

图3单分子力谱拉伸试验示意图（左），RrgA蛋白（FL）单分子力谱实验得到的单分子力谱图（右）。

三、结论

基于上述的研究，作者提出了Two-DomainBindingMode，在肺炎双球菌侵染宿主细胞的过程中，RrgA蛋白中D3、D4domain与宿主细胞表面的纤维蛋白能够以一种弱且短暂的结合力大规模快速扫描宿主细胞表面以便快速找到与肺炎双球菌特异性结合的受体蛋白，从而侵染宿主细胞。

图4肺炎双球菌侵染宿主细胞的过程中，RrgA蛋白Two-DomainBindingMode示意图