文献分享肺炎双球菌的另一种鞭毛蛋白在

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继昨天分享的年RrgA蛋白与宿主细胞表面的纤维蛋白的相互作用，Hauke教授在年在ACSNano发表了“Pilus?1BackboneProteinRrgBofStreptococcuspneumoniaeBindsCollagenIinaForce-DependentWay”通过使用原子力显微镜横向拉伸肺炎双球菌鞭毛蛋白RrgB，更好地模拟了生理条件下RrgB蛋白的运动方式，揭示了RrgB蛋白依靠力诱导的方式与宿主细胞表面胶原蛋白相互作用的方式，推翻了之前人们用免疫结合的方法得出的RrgB蛋白不与胶原蛋白作用的结论。

图1肺炎双球菌鞭毛和RrgB蛋白结构示意图

在之前已经介绍了肺炎双球菌鞭毛蛋白的组成，这里不过多赘述，主要介绍RrgB蛋白，RrgB蛋白也是由四个domain组成，与RrgA蛋白不同的是，RrgB蛋白的D2和D3是并排排列的，之间由Loop相连，像一个钩子的模样。这也是HaukeClausen-Schaumann教授在实验前认为RrgB蛋白与胶原蛋白存在相互作用的原因。

实验部分

首先，RrgB蛋白用带羧基的PEGlinker固定在针尖上，而胶原蛋白则是无序固定在玻璃基板上进行竖直的单分子力谱拉伸实验，统计得到有15％概率产生24.35±0.90pN的相互作用力，有1.5%概率出现大于pN的相互作用力，而对照实验（针尖只有PEGlinker不固定RrgB蛋白）只有6%出现20pN左右的力信号。证明了RrgB蛋白的确是跟胶原蛋白存在相互作用的。免疫亲和法是在一种静态下的实验方法，原子力显微镜则是一种动态实验，结果的不同说明了RrgB蛋白与胶原蛋白的相互作用是需要依靠力去激发的。之后通过分子生物学突变通过在C端引入半胱氨酸与针尖形成二硫键固定D2与D3之间形成的空隙的方向（该方向是了RrgB蛋白在生理状态下与胶原蛋白的接触方向），并用不同速度拉伸，发现RrgB蛋白与胶原蛋白之间的结合力随速度的增加而增加，分析原因，是因为速度增加导致D2与D3之间形成的空隙增加，RrgB蛋白与胶原蛋白之间的结合位点也增加了。为了更加真实的模拟RrgB蛋白在与胶原蛋白之间的结合，之后改用横向拉伸的方法进行单分子力谱试验，其拉伸力的计算公式为：

其中l、h、t分别为针尖的长度、高度、厚度，k为垂直方向的针尖弹簧系数，Sn为垂直方向激光的灵敏度，V为拉伸速度。可以看到k与Sn都是垂直方向上的参数，所以存在较大误差，但仍可以做为横向比较来用。实验发现RrgB蛋白与胶原蛋白之间的结合力随拉伸速度的增加呈先增加后减少的趋势，是因为随着速度的加快，蛋白之间还未来得及产生相互作用就被拉走了，并且存在pN的超大力，证明了RrgB蛋白具有稳定的机械强度，是固定肺炎双球菌的主要蛋白。

图2（a）RrgB蛋白垂直拉伸单分子力谱实验示意图，（b）RrgB蛋白生理条件空隙方向的垂直拉伸单分子力谱实验示意图，（c）RrgB蛋白生理条件空隙方向的横向拉伸单分子力谱实验示意图。

结论

RrgB蛋白与胶原蛋白之间的结合力是一种依靠力诱导的方式结合的，在生物体内这种力就是血管中血液流动或者气管中气体流动的剪应力。在生物体内D3domain充当一个“分子钩”的作用，帮助肺炎球菌在剪应力下将其固定在宿主细胞表面。同时D2domain和D2domain和D3domain之间的Loop上同样存在了与胶原蛋白结合的位点。

图3在生物体内,RrgB蛋白在剪应力下固定肺炎双球菌于宿主细胞表面